ОЦЕНКА ОТНОСИТЕЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИГЕНА НА ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММАХ

Описанный в предыдущем разделе вариант метода, будучи применен в сочетании с простым электрофорезом, позволяет определить относительное содержание исследуемого антигена на электрофореграммах сывороток или тканевых экстрактов.

В отличие от описанного выше варианта, при сочетании иммунофильтрации с простым электрофорезом необходимо удалить белки фильтра из зоны расположения антигенов, поскольку и те и другие будут выявляться при фиксации и окраске электрофо-реграммы.

В зависимости от особенностей изучаемой системы могут применяться различные модификации основного метода.

В качестве примеров мы приведем два случая — определение на электрофореграммах а F-глобулина в сыворотках крыс и мышей. Особенностью крысиных сывороток является то, что альбумин в них при электрофорезе в агаре «накладывается» на фракцию а - глобулинов, в частности а F-глобулина, и при окраске белковых зон сыворотки новорожденных или эмбрионов на электрофореграммах образуется общее пятно альбумина и ар-глобулина.

Оценить относительную концентрацию обоих антигенов в общем пятне можно лишь путем избирательной элиминации одного из них. При этом следует иметь в виду, что в сыворотках крысиных эмбрионов в образовании суммарной зоны не принимают участия другие компоненты, кроме альбумина и а F-глобулина.

Избирательная элиминация может быть осуществлена путем иммунофильтрации исследуемой сыворотки через фильтр анти-ВС-сыворотки или через фильтр анти-НС, предварительно истощенной очищенным препаратом сывороточного альбумина. В первом случае достигалась избирательная элиминация всех компонентов, имеющихся в сыворотке взрослых животных, и на электрофореграммах оставался только av (82), а во втором уходили все компоненты, включаяccf , и оставался только альбумин.

Техника проведения эксперимента в этом случае несколько отлична от описанной в предыдущем разделе. Включение фильтра в агар проводят, как и в предыдущем варианте (83, /, //). После включения фильтра (83, //) делают разрез по катодному краю резервуара F, всю зону агара, расположенную к аноду от разреза, удаляют и заменяют свежим агаром. При этом удаляют все белки сыворотки с анодной подвижностью, которые могут мешать при последующем выявлении антигенов, мигрирующих к аноду.

Если исследуемый материал имеется в ограниченном количестве, как, например, сыворотки эмбрионов, то можно пользоваться обычными лунками для антигенов, как это делается при иммуноэлектрофорезе.

В агаре по линии разреза делают узкий резервуар R (83, ///), который заполняют исследуемым антигеном (для устранения возможных аномалий рекомендуется диализ антигена против буфера с ионной силой 0,025). Полюса переключают и электрофорез проводят до возвращения пиронина в исходное положение или несколько дальше к катоду. После этого препарат фиксируют и окрашивают на белок обычным образом (83, IV).

Сравнивая зону К, мигрировавшую в слое чистого агара, с зоной Е, прошедшей через фильтр, можно определить положение и оценить относительную концентрацию специфического антигена в системе.

Поскольку для проявления белковых зон окрашиванием обычно требуется большее количество вещества, чем для иммуноэлектрофореза, то в описанной модификации чаще всего применяется «фильтрация» через двойной фильтр.

Описанный вариант иммунофильтрации лучше всего проводить в приборе для высоковольтного электрофореза. При этом значительно сокращается время эксперимента (40—60 минут), достигается минимальный размыв зон и предельная экономия материала.

На 84 и 85 представлены результаты иммунофильтрации сыворотки крысиных эмбрионов и новорожденных крысят через анти-ВС и анти-НСд фильтры. Видно, что общая зона альбумина и а?-глобулина в сыворотке эмбрионов состоит в основном из a f, а в сыворотке новорожденных крысят соотношения меняются в пользу альбумина. Полнота «фильтрации» в обоих случаях контролировалась иммунопроявлением в параллельных опытах с теми же соотношениями реагентов.

На 86 представлен результат фильтрации а2-глобулиновой фракции сыворотки новорожденных мышей через анти-ВС и анти-Hd «фильтры». Сопоставление результатов фильтрации через гомологичную и гетерологичную антисыворотки ясно показывает, что вся зона а-глобулина сыворотки новорожденных мышей, выявляемая окраской, на электрофореграмме практически состоит из ссf -глобулина.

Примеси к нему, проходящие сквозь фильтр анти-НСгх обнаруживаемые иммунопроявлением, находятся в концентрации не превышающей порога чувствительности простого электрофореза. В случае сравнимых концентраций специфического антигена и примесей к нему возможна количественная обработка зоны, прошедшей сквозь фильтр (Е), и контрольной (К) на денситометре.

Таким образом, иммунофильтрация в сочетании с простым электрофорезом позволяет получить окрашенную зону исследуемого антигена на электрофореграмме, точно локализовать положение исследуемого антигена в электрофоретическом спектре сопутствующих компонентов и оценить его относительную концентрацию в определенной фракции препарата.

В этом варианте проводится «микроочистка» исследуемого вещества. Характеристические реакции {12} с зоной очищенного

антигена могут дать дополнительную характеристику его химической природы и физиологической активности.

Одна из наиболее интересных возможностей с этой точки зрения — определение включения меченых аминокислот в индивидуальные антигены, на чем мы остановимся в следующем разделе.

http://medicadverts.ru/ - медицинские советы Марии Струбциновой